3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較

［摘要 ］研究和比較3種檢測吡咯喹啉醌（PQQ）的方法，確定各種方法的特點和適用范圍。

［關(guān)鍵詞］吡咯喹啉醌 ；檢測方法；電泳法（Native－PAGE 法）；光譜法；NBT－Gly 法。

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)的一種不同于吡啶核苷酸（NAD、NADP）和核黃素（FMN、FAD）的第三類輔酶。PQQ適合生物發(fā)酵法生產(chǎn)。為了簡單快速的檢測發(fā)酵液中的PQQ，我們設(shè)計并改進了3種檢測方法：Native－PAGE 法（Native－PAGE 法）、光譜法、和NBT-Gly法。

本文利用山梨脫氫酶與其專一性輔酶PQQ結(jié)合催化底物山梨糖的特性，設(shè)計了利用氯化硝基四氮唑藍染色體檢測Native－PAGE 法中PQQ的方法。

光譜法是以D_326nm值與D_400nm值來檢測PQQ的含量。

NBT-Gly法利用了PQQ的氧化還原特性，參照文獻加以改進，引入96孔板和酶標儀，縮小了反應(yīng)體系，增加了一次檢測的樣品數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 材料（具體見文獻）

1.2 樣品制備（具體見文獻）

1.3 分別用活性電泳檢測法、光譜法、NBT-Gly法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 檢測限和線性范圍

利用PQQ標準品確定了3種方法的PQQ檢測限，活性電泳檢測可檢測出12.6ng/ml以上的PQQ含量；光譜法檢測，當△D_326nm-400nm為0-0.7時，PQQ濃度與吸光度之間的線性關(guān)系良好，線性范圍為2.46-26.27μg /ml。NBT-Gly法的線性范圍為44.250ng/ml-1.416μg /ml，由于還原型NBT的不溶解性，高濃度時呈絮狀，導(dǎo)致吸光度值下降。

2.2 精密度實驗

考察了光譜法和NBT-Gly法的組內(nèi)精密度和組間精密度。在各方法的線性范圍內(nèi)選擇5個PQQ濃度，n=3。其具體數(shù)值見表1

2.3 樣品檢測和加樣回收率

采用Native－PAGE 法檢測供試樣品時，在同一塊聚丙烯凝膠上與不同濃度的標準品相比，3個樣品的PQQ含量大量為6.25-12.5μg /ml.用NBT-Gly法和光譜法檢測樣品PQQ含量時，在相同條件下制作標準曲線，通過回歸方程計算得到樣品的PQQ含量（表2、3）。在供試品中加入標準品，考察加樣回收率（n=3）（表2、3）。進行樣品檢測時，光譜法必須扣除培養(yǎng)基背景干擾，而其它兩法可忽略。

3  討論

Native－PAGE 法 PQQ 檢測下限為 12.6 ng / m L，靈敏度高，而且利用了 SDH 與輔酶和底物相互作用的特異性，抗干擾性強，適于培養(yǎng)上清等復(fù)雜樣品的粗略定量。 但該法不能用于 PQQ 的準確定量，因而未考察其精密度和加樣回收率。

光譜法在 PQQ 濃度為 26.27 μg /m L～2.46 μg /m L 時與吸光度值呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，精密度好。進行發(fā)酵樣品上清中 PQQ 含量檢測時，可將樣品進行適當稀釋，使 PQQ 含量落在光譜法的線性范圍內(nèi)。

NBT－Gly 法線性關(guān)系較好，在 1.416 μg / m L～44.250 ng / m L 時呈線性關(guān)系 ， 但重復(fù)性不佳 ，RSD偏高，加樣回收率為 99．64％～119．68％。 NBT－Gly 法的優(yōu)點是操作簡便，一次可檢測多個樣品。

由于Native－PAGE 法檢測的靈敏度很高，在篩選 PQQ 產(chǎn)生菌時，可先進行Native－PAGE 法檢測，確定是否含有PQQ，后用光譜法和 NBT－Gly 法進行定量。 NBT－Gly 法操作簡便，檢測量大，有利于從大量樣品中篩選高產(chǎn)菌株。光譜法精密度高，但在檢測樣品時會受到培養(yǎng)基的干擾，將 PQQ 純化后用此方法檢測可得到精確的 PQQ 濃度。

本文為PQQ檢測提供了3種簡便易行的方法，不需要昂貴的儀器，操作過程簡單，可根據(jù)實際需要選用。

文獻

[1] 楊延新，熊向華，游松，張惟材.3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較[J].生物技術(shù)通訊2011，22（22）：544-547